Возможности традиционной и жидкостной цитологии в сочетании с иммуноцитохимической детекцией некоторых молекулярных маркеров в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы

Распространенность рака щитовидной железы (РЩЖ) увеличилась c 2003 до 2014 г. почти в 2 раза – с 55 до 97,1 на 100 000 населения [1]. До сих пор проблема дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы (ЩЖ) остается актуальной и является причиной выполнения большого количества “лишних” оперативных вмешательств, процент которых, по данным разных авторов, достигает 71% [2].

Особо сложна предоперационная дифференциальная диагностика фолликулярного РЩЖ/фолликулярной аденомы и фолликулярной формы папиллярного РЩЖ. Так как на этапе цитологического исследования эти формы патологии невозможно дифференцировать, было предложено использовать генетические методы исследования, однако их выполнение достаточно длительное и дорогостоящее [3, 4].

Известно, что индукция и промоция РЩЖ осуществляются в результате мутаций в разных онкогенах, что приводит к ингибированию апоптоза, пролиферации клеток и повышению экспрессии определенных рецепторов [5]. Вследствие этого для диагностики различных гистопатологических групп узлового образования ЩЖ было предложено множество биомаркеров. Большее количество этих исследований по понятным причинам проведено напостоперационном материале. К настоящему времени уже определился круг наиболее перспективных молекулярных маркеров, которые можно использовать для дифференциальной диагностики доброкачественных/злокачественных узловых образований ЩЖ. Однако на всех этапах исследования от пред- до послеоперационного встречается немалое количество противоречий в молекулярной дифференциальной диагностике узловых образований ЩЖ.

На примере использования некоторых онкомаркеров высокодифференцированного РЩЖ осветим данную проблему.

Галектин-3

Это галактозид-связывающий белок с молекулярной массой 26 кДа, принадлежащий к семейству галектинов. Показано, что галектин-3 контролирует клеточный цикл и препятствует апоптозу T-клеток путем взаимодействия с членами семейства Bcl-2. Экспрессия этого лектина повышается не только при воспалении, но и при пролиферации, дифференцировке клеток, а также при опухолевой трансформации.

Достаточно много работ посвящено иммуноцитохимическому методу определения экспрессии данного маркера. Одни авторы считают, что обнаружение галектина-3 в пунктате узлового образования ЩЖ со специфичностью 100% свидетельствует о раке, что исключает необходимость повторного цитологического исследования, однако данный метод обладает низкой чувствительностью (55%), что неминуемо приведет к гиподиагностике рака [6]. Другие, наоборот, находят высокую чувствительность дооперационного определения экспрессии данного маркера (93,8%), но более низкую специфичность (67,3%) в установлении диагноза РЩЖ иммуногистохимическим (ИГХ) методом. Однако имеются данные, что c помощью другого метода – полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени нельзя достоверно различить доброкачественную и злокачественную патологию [7].

В 2015 г. был опубликован патент на метод диагностики высокодифференцированного РЩЖ, основанный на исследовании уровня галектина-3 в смыве аспирата, полученного при тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) из узлов ЩЖ методом иммуноферментного анализа (ИФА) [8]. Содержание галектина-3 в смыве ниже 1,0 нг/мл авторы предлагали оценивать как критерий отсутствия высокодифференцированного рака, выше 1,6 нг/мл – диагностировать как высокодифференцированный рак. Чувствительность данного метода в диагностике высокодифференцированного РЩЖ оценивалась на уровне 59,7%, специфичность – 90,7%. Однако недостатком метода ИФА является низкая воспроизводимость, так как уровень определяемого маркера напрямую зависит от количества полученного пункционного материала, а следовательно, результаты оценки данного белка при проведении пункционной биопсии в другом медицинском учреждении или другим специалистом будут отличаться от полученных. Этим же авторским коллективом было предложено аналогичным способом интерпретировать уровеньтиреоглобулина: его содержание менее 272,5 нг/мл предполагало отсутствие высокодифференцированного РЩЖ, определение в интервале 272,5–355,5 нг/мл – определяло риск высокодифференцированного РЩЖ, выше 355,5 нг/мл – позволяло диагностировать РЩЖ. Чувствительность данного метода, по мнению авторов, составляет 64,9%, специфичность – 95,3%.

Некоторые исследователи приходят к выводу, что определение галектина-3 нельзя использовать в качестве единственно необходимого и достаточного молекулярного анализа, несмотря на то что экспрессия данного маркера достоверно отражает высокую вероятность злокачественного характера узла ЩЖ, но только в комбинации с другими маркерами [2, 9, 10].

Ki-67

Наиболее специфическим маркером для установления выраженности пролиферативных процессов в ткани является Ki-67. Экспрессия Кi-67 позволяет выделить опухолевые клетки, находящиеся в различных фазах клеточного цикла, кроме G0, и распознается с помощью моноклональных антител [11]. Различными исследователями отмечается важность оценки индекса пролиферативной активности в дифференциальной диагностике фолликулярных аденом и карцином ЩЖ. Есть работы, где уровень экспрессии Ki-67 при ИГХ-исследовании был достоверно выше в злокачественных новообразованиях ЩЖ, в том числе и при фолликулярном раке, в отличие от доброкачественного процесса [12–15].

Однако существует необходимость установления пороговых значений для дифференцировки злокачественных и доброкачественных новообразований ЩЖ по уровню экспрессии данного маркера. Есть работы, в которых подобная закономерность характерна только в отношении фолликулярной аденомы и карциномы, но увеличение Ki-67 не отмечалось при папиллярном РЩЖ [16]. В некоторых же исследованиях [17, 18], наоборот, отмечается уменьшение экспрессии белка Ki-67 в ЩЖ больных папиллярным, в меньшей степени фолликулярным раком [19] по сравнению с доброкачественными изменениями. Другие исследователи вообще не выявили статистически значимых различий в экспрессии Ki-67 между папиллярным раком и доброкачественными узловыми образованиями в ЩЖ, но отметили, что данный маркер предоставляет полезную информацию о пролиферативной активности ткани ЩЖ [20]. В одной из последних работ авторы предлагают третью стадию пролиферации (повышение индекса пролиферации Ki-67 более 70% при послеоперационном исследовании методом ИГХ) оценивать как дисплазию III степени и считать предраковой [21].

Нуклеофосмин (NFM)

Этот ключевой нерибосомный белок ядрышка является переносчиком белков, постоянно мигрирующих между ядром и цитоплазмой, он осуществляет защиту белков от агрегации [22]. По данному маркеру (NFM) есть исследования, в которых методом ИГХ было выявлено увеличение экспрессии данного маркера в фолликулярных аденомах и папиллярной карциноме в отличие от нормальной ткани ЩЖ [23]. Из чего авторы сделали вывод, что избыточная экспрессия нуклеофосмина в ткани ЩЖ является ранним признаком трансформации в опухолевую ткань. К сожалению, за рубежом проводились единичные исследования, посвященные изучению диагностической ценности определения нуклеофосмина при РЩЖ, а в России такие исследования не проводились вовсе.

Таким образом, в литературе представлены различные противоречивые сведения по данным белкам в качестве онкомаркеров РЩЖ: например, чувствительность галектина-3 в диагностике злокачественной патологии колеблется от 55 до 93,8%, а специфичность – от 67,3 до 100%, одни авторы отмечают увеличение экспрессии Ki-67, другие – уменьшение. Предлагаются также различные методы исследования данных белков, что, несомненно, повлечет и большой размах диагностических критериев, и различные уровни диагностической точности. Однако, несмотря на все противоречия, появляются новые современные и перспективные методы исследования, такие как жидкостная цитология, клеточная сепарация, которые предоставляют большую возможность для точной и надежной дооперационной дифференциальной диагностики РЩЖ, что и является основанием для дальнейшей апробации данных белков в качестве онкомаркеров высокодифференцированного РЩЖ, а также его различных гистологических вариантов.

Цель исследования – установление диагностической значимости жидкостной и традиционной цитологической диагностики с иммуноцитохимической детекцией (ИЦХ) белков (галектина-3, нуклеофосмина, Ki-67) в дооперационной диагностике высокодифференцированного РЩЖ. Задачей исследования также явилось проведение анализа возможного влияния на точность диагностики РЩЖ используемыми методами на фоне аутоиммунного процесса в ЩЖ.

Материал и методы

Дизайн исследования: обсервационное одномоментное неконтролируемое исследование. В исследование было включено 749 пациентов с узловым или многоузловым зобом, которым была показана ТАБ с последующим проведением цитологического исследования. Учитывались следующие данные: пол, возраст, стаж заболевания, известные факторы риска развития РЩЖ, данные общеклинического обследования (общий и биохимический анализ крови), гормонального профиля (тиреотропный гормон, св. Т4, св. Т3, антитела к тиреопероксидазе и тиреоглобулину), УЗИ щитовидной железы, проведенные на базе различных поликлиник города Томска, эндокринологического отделения консультативно-диагностической поликлиники ОГАУЗ ТОКБ, отделения хирургии ОГАУЗ ТОКБ, отделения общей хирургии ГБОУ ВПО СибГМУ, НИИ онкологии за период 2012–2015 гг. Пациентам по показаниям выполнялась ТАБ под контролем УЗИ. Показаниями к ее проведению, согласно клиническим рекомендациям Российской ассоциации эндокринологов по диагностике и лечению узлового зоба [24], являлись: наличие узла размером 1 см и больше, а также узла меньше 1 см в сочетании с клиническими или ультрасонографическими признаками, позволяющими заподозрить его злокачественный характер.

При наличии нескольких узлов производилась пункция наиболее подозрительных образований. Для цитологического исследования аспираты окрашивались азур-эозином по Гимзе. Из 749 пациентов 107 (14,3%) пациентам дополнительно к традиционному цитологическому (ТЦ) исследованию было выполнено исследование методом жидкостной цитологии (ЖЦ). Причем первых (47% от 107) пациентов повторно не пунктировали, а использовали иглу со шприцем после той же пункции, из которой брали материал для ТЦ. После получения первых результатов ввиду большого количества неинформативного материала (отсутствие клеток) при ЖЦ последующих пациентов (60% от 107 человек) пунктировали отдельно, и материал полностью использовался для ЖЦ. Для приготовления мазков для ЖЦ пунктат фиксировали в 1 мл стабилизирующего раствора Preservative Solution Novaprep, далее в лаборатории готовили цитологические препараты на адгезивных стеклах центрифугированием 5 мин при скорости вращения ротора 1000 об/мин (Cellspin II (Tharmac, Германия)), окрашивание по Папаниколау осуществляли на автоматическом приборе АФОМК-13-ПАП (ЭМКО, Россия), программа EMCO-PAP-16, с последующим определением экспрессии маркеров Ki-67, NFM и галектина-3. ИЦХ проводили непрямым трехступенчатым иммуноферментным LSAB (англ. Labeled streptavidin – biotin, DAKO Cytomation, LSAB 2 System – HRP) методом визуализации. Выявление пероксидазной активности осуществляли с помощью 3,3-диаминобензидина.Цитопрепараты докрашивали гематоксилином Майера. Подсчет иммунопозитивных клеток проводили в областях с максимальным проявлением диаминобензидина при анализе 200–300 клеток на микроскопе Axioskop (ZEISS, Германия). Оценивался показатель HS (Histochemical Score), который рассчитывался по формуле: HS = ∑P(i) × i, где i – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах (от 0 до 3), P(i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Окончательная верификация диагноза при узловом зобе осуществлялась путем анализа постоперационных гистологических препаратов, которые были приготовлены по стандартным методикам и окрашивались гематоксилином и эозином.

Статистическая обработка данных проводилась в программе SPSS Statistics 20. Описание количественных признаков, не соответствующих нормальному закону распределения, представлено в виде медианы и межквартильногоразмаха (Me(Q1–Q3)). Сравнение двух независимых выборок по количественному признаку проводилось при помощи критерия Манна–Уитни, анализ качественных признаков – при помощи критерия хи-квадрат и точного критерия Фишера. Оценка взаимосвязи признаков проводилась при помощи корреляционного анализа путем расчета рангового коэффициента корреляции Спирмена. Критический уровень значимости в работе принят равным менее 0,05.

Методом бинарной логистической регрессии выявлены значимые предикторы, ассоциированные с наличием злокачественного образования в ЩЖ. Оценка качества логистической регрессионной модели проводилась путем расчета характеристик чувствительности, специфичности и точности модели.

Результаты и обсуждение

Клиническая группа пациентов с узловым зобом, у которых проведено традиционное жидкостное цитологическое исследование с верификацией диагноза по постоперационному гистологическому заключению, представлена 107 пациентами, среди которых 97 (90,5%) женщин и 10 (9,5%) мужчин. Возрастной диапазон пациентов составил от 23 до 82 лет, средний – 52,8 ± 12,6 года.

В первой подгруппе пациентов (пункция данным пациентам проводилась 1 раз, а материал отправлялся и на традиционное цитологическое исследование, и на ЖЦ) ввиду особенностей забора образцов было большее количество неинформативного материала при ЖЦ (63% против 13%), чем во второй подгруппе (пациенты, которых пунктировали дважды: для ТЦ и отдельно для ЖЦ с последующей ИЦХ). Из чего мы сделали вывод, что для проведения ЖЦ пациенту необходимо осуществлять отдельную пункцию. Цитологические заключения согласно классификации Bethesda 2009 г. для первой и второй подгруппы представлены в табл. 1.

При помощи построения таблиц сопряженности (для общей группы пациентов) было установлено, что метод ТЦ в отношении диагностики РЩЖ на дооперационном этапе обладает чувствительностью 67%, специфичностью 92,5% и точностью 83%, ЖЦ – 65, 98 и 88% соответственно (табл. 2, 3).

ИЦХ была проведена 56 (52,3% из 107 пациентов) пациентам на материале, взятом на ЖЦ, в случае, если материал был информативным. На этапе гистологического исследования этим пациентам были выставлены следующие заключения: коллоидный зоб – 24 случая, аутоиммунный тиреоидит (АИТ) – 14 случаев (из них 8 являлось фоном узлового коллоидного зоба), фолликулярная аденома – 4 случая, папиллярный рак – 22 случая, из них 1 случай папиллярного рака с фокусами фолликулярного.

Мы определяли корреляцию экспрессии маркеров Ki-67, NFM, галектина-3, выраженной в Histochemical Score (HS), с наличием РЩЖ. HS маркеров NFM и галектина-3 не продемонстрировал корреляции с высокодифференцированным РЩЖ (р = 0,2 и р = 0,15 соответственно). HS Ki-67 показал сильную положительную корреляцию (р < 0,05, r = 0,8) с наличием рака в ЩЖ. Результаты сравнения HS Ki-67, NFM, галектина-3 представлены в табл. 4. Как видно из таблицы, оценка HS NFM и галектина-3 незначима для выявления РЩЖ. Уровень же HS Ki-67 в группе пациентов с карциномой ЩЖ был значимо выше.

При помощи метода бинарной логистической регрессии были проанализированы потенциальные предикторы РЩЖ на основании определения HS Ki-67, галектина-3 и NFM. В результате пошагового отбора в модель не вошли такие показатели как HS галектина-3 и NFM, так как данные признаки имели уровень значимости низкий (p > 0,05) и в полученной формуле не принимали участие. Так как HS Ki-67 коррелировал с риском выявления РЩЖ, то только на основании включения данного коэффициента и была построена модель, которая позволяет предположить злокачественный процесс (табл. 4).

Представленная модель продемонстрировала статистическую значимость (÷2 = 22,78, р < 0,001). Качество построенной модели характеризуют: коэффициент множественной детерминации (R2 Найджелкерка = 0,769), критерий согласия Хосмера–Лемешова (÷2 = 3,34, р = 0,647), коэффициент конкордации – 88,9%, чувствительность – 81,8%, специфичность – 93,8%, точность – 88,8%, предсказательная ценность положительного результата – 90%, предсказательная ценность отрицательного результата – 88,2%.

Однако с учетом того, что в формулу вошел только один маркер, значимость расчета данного показателя была определна и ROC-анализом. Площадь под кривой составила 0,96. Отрезной диагностической точкой был определен уровень HS Ki-67 35,0, при котором чувствительность метода его определения составила 81,8%, специфичность – 100%, точность – 92,5%.

При учете результатов двух методик – ТЦ и определения HS Ki-67 – диагностическая ценность улучшалась до 93,3% чувствительности и 100% специфичности, а с использованием метода ЖЦ + определение HS Ki-67 – до 100% чувствительности и специфичности.

Аутоиммунные заболевания ЩЖ относятся к числу многофакторных патологических процессов, развитие которых определяется генетическими, гормональными факторами, а также факторами внешней среды [25]. Мы также предприняли попытку установить возможное наличие связи экспрессии маркеров Ki-67, NFM, галектина-3 с сопутствующим аутоиммунным процессом в ЩЖ, но не обнаружили статистически значимых различий изучаемыхонкомаркеров на фоне АИТ и без него (табл. 5).

Однако наличие аутоиммунного процесса значимо влияло на правильность постановки цитологического диагноза: при ТЦ процент ошибки был выше при аутоиммунном процессе, чем без данной патологии, – 42,9% против 10% (÷2 = 3,7, р = 0,05), при проведении ЖЦ наличие АИТ не искажало точность цитологического диагноза (÷2 = 0,1, р = 0,7), однако тенденция сохранялась (процент ошибки – 14,3% против 9,5%). Таким образом, метод ЖЦ позволяет более точно, чем метод ТЦ, выявлять тип патологического процесса в ЩЖ при наличии сопутствующего АИТ и имеет преимущество при учете данной патологии. Плюсы данного метода складываются из технологиицитоцентрифугирования, которая обеспечивает индивидуальный подход к каждому образцу, позволяет учитывать концентрацию клеточного материала в питательной среде, дает возможность равномерного распределения клеточного материала на стекле, лучшей визуализации деталей ядра и цитоплазмы, значительного снижения числа элементов воспаления, эритроцитов, артефактов, достижение более тщательного анализа структур клетки. Хотя в литературе указывается и обратная ситуация: при диагностике АИТ есть трудности при проведении именно ЖЦ, так как реактивные изменения эпителия ЩЖ из-за отсутствия лимфоидных элементов могут быть ошибочно приняты за комплексы папиллярного рака. Так, значительное снижение или отсутствие фоновых элементов, с одной стороны, позволяет сконцентрировать патологические клетки в препарате, детально рассмотреть особенности морфологии ядра и цитоплазмы, с другой – лишает важной диагностической информации [26, 27].

Выводы

1. Метод иммуноцитохимического определения экспрессии Ki-67 обладает высокой чувствительностью (81,8%), специфичностью (100%) и точностью (92,5%) на дооперационном этапе диагностики РЩЖ, а совместное определение HS Ki-67 и проведение жидкостного цитологического исследования повышает чувствительность и специфичность дооперационной диагностики высокодифференцированного РЩЖ до 100%.
2. Разработана формула, которая на основании определения HS Ki-67 позволяет с высокой точностью определить наличие злокачественного процесса в ЩЖ. Однако требуются дальнейшие исследования в данном направлении, особенно в группе пациентов с фолликулярной неоплазией, установленной по данным цитологического заключения.
3. Не обнаружено связи между экспрессией маркеров галектина-3, NFM, Ki-67 и наличием аутоиммунного процесса в ЩЖ.
4. Диагностическая точность метода жидкостной цитологии выше, чем метода традиционной цитологии, в отношении обнаружения злокачественной патологии в ЩЖ (88% против 83%), особенно при наличии сопутствующего аутоиммунного воспалительного процесса.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Исследования выполнены при поддержке Гранта совета при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ (№ НШ-4184.2014.7, НШ-7906.2016.7), Гранта совета при Президенте РФ для поддержки молодых докторов наук (№ 16.120.11.1233-МД).

Все авторы заявляют об отсутствии потенциальных и явных конфликтов (двойственности) интересов, связанных с публикацией данной статьи

Участие авторов: Берёзкина И.С. – сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, написание текста; Саприна Т.В. – концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, написание и редактирование текста; Зима А.П. – концепция и дизайн исследования; Исаева А.В. – сбор и обработка материалов; Латыпова В.Н. – сбор информации; Мухамедов М.Р. – сбор информации; Базилевич Л.Р. – сбор информации; Попов О.С. – сбор информации; Касоян К.Т. – анализ полученных данных; Брынова О.В. – анализ полученных данных; Бразовская Н.Г. – статистическая обработка данных.